Hoppa till huvudinnehåll
Göteborgs universitet
Bild
Forskare på MPE arbetar med ÄKTA utrustningen
Foto: Charbel Sader
Länkstig

Så använder du MPE:s facilitet

Vi hjälper er att producera proteiner eller odla celler för er forskning. På vårt cellodlingslab utför vår egen personal allt arbete som behövs (pga risken för kontamineringar i ett cellodlingslab), men vad gäller övrigt arbete kan ni gärna hjälpa till.

Det kan vara t ex vektorkonstruktioner samt analys av de proteiner vi producerat, beroende på vad ni själva har för kunskaper och erfarenheter. Om ni vill utför vi även dessa steg. Kontakta oss gärna för att diskutera lämpligt upplägg för era proteiner.

Producera ett protein

Vid MPE producerar vi rekombinanta proteiner i mammalieceller, ett expressionssystem som även kan producera stora, sekretoriska proteiner med post-translationella modifieringar såsom glykosylering, disulfidbindningar och proteolytiska klyvningar.

 

Vi hjälper er att producera proteiner eller odla celler för er forskning. På vårt cellodlingslab utför vår egen personal allt arbete som behövs (pga risken för kontamineringar i ett cellodlingslab), men vad gäller övrigt arbete kan ni gärna hjälpa till. Det kan vara t ex vektorkonstruktioner samt analys av de proteiner vi producerat, beroende på vad ni själva har för kunskaper och erfarenheter. Om ni vill utför vi även dessa steg. Kontakta oss gärna för att diskutera lämpligt upplägg för era proteiner.

Ett typiskt arbetsflöde kan se ut så här:

1. Vektorkonstruktion. cDNA för ditt protein måste klonas in i en expressionsvektor för mammalieceller. Har ni möjlighet kan ni göra detta steg själva eller så gör vi det på MPE. Vi kan också hjälpa till vid beställning av kommersiell färdig vektor.

2. Transfektion och kloning. Vektorn transfekteras sedan in i celler för generering av stabila, producerande kloner. Analys av klonerna kan antingen göras av MPE eller av er.

3. Anpassning. En utvald, hög-producerande klon måste sedan anpassas för att växa i suspension i serum-fritt medium, innan den kan odlas i en bioreaktor.

4. Bioreaktorodling. När en klon är färdiganpassad, kan den odlas i en bioreaktor för att producera en större batch av ditt protein. Vi använder perfusionsodling där supernatant från odlingen skördas kontinuerligt och vi samlar vanligtvis 10-20 liter, beroende på uttrycksnivån och hur mycket protein som önskas.

5. Koncentrering och rening av produkt. Det skördade mediet koncentreras sedan med ”Tangential Flow Filtration”, för att få mer hanterbara volymer. Proteinet kan därefter renas med t ex affinitetskromatografi.

6. Produktanalys. SDS-PAGE, Western blot eller ELISA för det producerade proteinet kan köras parallellt med samtliga steg ovan, antingen av MPE eller av er.

Som ett alternativ till ovanstående flöde, kan vi även producera proteiner genom transient transfektion av CHO eller HEK293 celler i upp till 1.5L skala. Då ersätts steg 2-4 ovan av en större transfektion av många celler, vilken lämpligen görs i våra bioreaktorer. Detta är ett bra alternativ om man vill ha proteinet snabbare.

I den post-genomiska eran kommer möjligheten att uttrycka olika proteiner för att kunna studera dessas funktioner att vara av stigande betydelse. Många mindre, intracellulära proteiner kan uttryckas i bakterier, jäst eller insektceller, men större och framförallt sekretoriska proteiner kan ej uttryckas i dessa system. Anledningen till det är de kontrollsystem för sekretion som finns i endoplasmatiskt reticulum och även de glykosyleringssteg som förekommer i Golgi i däggdjursceller. För att uttrycka dessa större proteiner har valet av expressionssystem fallit på Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, både inom EU’s ”Animal Cell Factory”-projekt och inom bioteknikindustrin. Det är även den cellinje vi på MPE använder mest för detta syfte. CHO celler har några viktiga fördelar: 1) de kan anpassas till att växa i suspension, 2) de har ett effektivt system för protein folding och 3) produkter från CHO celler anses säkra för human användning.

Den vetenskapliga personalen vid MPE har arbetat med flera EU-finansierade projekt med syfte att producera olika väldefinierade glykoformer av proteiner för vaccinationsförsök mot bröstcancer. Detta har lärt oss hur man använder CHO celler för proteinexpression och även hur man kan manipulera glykosyleringen hos cellerna (både N- och O-glykaner). Vi har inom dessa EU-projekt samarbetat med Prof. Thomas Noll i Bielefeld, Tyskland, som tidigare var vid Biotechnology Research Center i Jülich, ett av de största och bästa instituten för produktion av rekombinanta proteiner i Europa, utanför bioteknikindustrin.Våra två grupper har tillsammans utvecklat och testat förhållandena för produktion av detta rekombinanta vaccin och vi fann att glukos-begränsad perfusionsodling (ett kontinuerligt odlingssystem där nytt medium pumpas in och använt medium pumpas ut med samma hastighet) var överlägset i produktivitet. Förutom den höga produktiviteten kunde proteinerna med lätthet isoleras från det skördade odlingsmediet. Eftersom proteinfritt odlingsmedium används kunde en minst 50%-ig renhet av proteinet erhållas direkt efter ett enkelt koncentreringssteg. Prof. Noll’s grupp har varit involverad i arbetet med att starta upp MPE och deras expertis kommer även fortsättningsvis att finnas tillgänglig för alla användare av faciliteten.

Odla celler

Vår personal utför cellodlingar för forskare som vill ha celler från t ex cellinjer i olika mängd. För celler som växer adherent på en plastyta har vi tillgång till stor inkubatorkapacitet samt flaskor och plattor för ändamålet. För celler som växer i suspension har vi spinner-flaskor för volymer upp till 300 ml samt flera skakinkubatorer för odlingar i E-kolv. Vi har också bioreaktorer med 1 liters- eller 3 literskärl för perfusionsodling för att erhålla mer optimala odlingsbetingelser vilket leder till högre proteinproduktion (upp till 20 liter medium). Detta odlingssätt använder vi för storskalig produktion av rekombinanta proteiner i Chinese Hamster Ovary (CHO) celler (se vidare under Produktion av rekombinanta proteiner).

Det betyder att vi kan odla många olika typer av cellinjer. Om du är intresserad av att odla någon cellinje vid MPE, vänligen kontakta oss.